分光光度法在現代生命科學研究中占據核心地位,其中賽默飛NanoDrop系列因其微量樣品檢測優勢而被廣泛應用。NanoDrop Eight是新一代微量分光光度計,能夠實現高通量、多樣品同時檢測,在核酸、蛋白及其他生物大分子研究中具有重要意義。與傳統比色皿檢測不同,NanoDrop Eight采用表面張力固定樣品的微量檢測模式,僅需1–2 μL試劑即可完成定量。但正因檢測體積極小,試劑的選擇對實驗結果影響極為顯著。
本文將從試劑選擇的重要性、NanoDrop Eight的檢測原理、常見試劑類型、不同實驗場景的試劑配置、試劑純度與保存要求、常見問題及解決方案,以及試劑選擇的優化策略等方面進行全面闡述。
保證測定準確性
NanoDrop Eight通過檢測在特定波長的吸收來計算濃度,如果試劑存在背景吸收或雜質,會直接影響核酸和蛋白定量。
減少實驗誤差
不同溶劑和緩沖液在紫外區透過率不同,選擇合適的試劑能降低基線噪聲,提高數據穩定性。
提高實驗重復性
一致的試劑來源和純度,能確保不同批次實驗結果具有可比性。
適應不同實驗需求
核酸、蛋白和細胞裂解產物對試劑的要求各不相同,合理選擇試劑有助于兼顧靈敏度和樣品保護。
NanoDrop Eight采用紫外-可見分光光度法,主要基于以下特征:
核酸:260 nm處有強吸收峰,濃度計算依賴A260值。
蛋白質:芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸)在280 nm處有特征吸收峰。
純度評估:A260/A280比值用于判定核酸純度;A260/A230比值用于判斷有機溶劑或鹽類污染。
紫外透射率高:在200–300 nm波段不能有明顯吸收。
純度高:避免雜質帶來的背景干擾。
穩定性好:長時間保存不發生分解或析出。
與樣品兼容:不破壞核酸或蛋白結構。
超純水(ddH?O):背景吸收低,適合純凈樣品稀釋。
TE緩沖液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0):穩定核酸,防止降解。
低鹽緩沖液(如10 mM Tris-HCl):減少鹽類在230 nm處的干擾。
PBS緩沖液(pH 7.4):適合大多數蛋白,生理條件下穩定。
HEPES緩沖液:良好的緩沖能力,紫外背景低。
低吸收緩沖液:避免含有高吸收的成分,如苯酚、咪唑等。
裂解液:用于細胞或組織提取物,但需注意其中成分(SDS、Triton X-100)在230 nm區域的吸收。
去污劑緩沖液:適用于膜蛋白或復合物提取,但可能干擾紫外吸收。
高濃度鹽溶液:常見于DNA提取后溶液,應盡量稀釋或透析以減少吸收干擾。
最佳選擇:TE緩沖液或低鹽Tris緩沖液。
原因:在260 nm附近吸收低,能穩定核酸,減少金屬離子誘導的降解。
最佳選擇:DEPC處理的無RNA酶水。
原因:避免RNA酶污染導致降解,同時保證紫外背景低。
最佳選擇:PBS或HEPES緩沖液。
原因:背景吸收小,且能保持蛋白構象穩定。
策略:盡量使用不含苯酚、胍鹽或高濃度去污劑的裂解液,避免在230 nm區域產生強吸收。
方法:統一使用紫外低吸收的緩沖液,以兼顧核酸和蛋白質的檢測。
核酸檢測試劑
使用超純水(電阻率≥18 MΩ·cm)。
TE緩沖液應避光保存,避免pH變化。
蛋白檢測試劑
PBS緩沖液需高純度制備,避免有機污染。
HEPES溶液應分裝冷凍保存,減少降解。
裂解液與特殊試劑
現配現用,避免長期保存導致成分分解。
使用前可通過NanoDrop進行背景檢測,確保無明顯吸收。
A260/A280比值偏低
可能原因:蛋白污染。
解決方法:更換試劑或重新純化樣品。
A260/A230比值偏低
可能原因:鹽類或有機溶劑殘留。
解決方法:更換低鹽緩沖液,透析或純化。
基線不穩定
可能原因:試劑存在微量吸收或雜質。
解決方法:重新配制新試劑,使用高純度水。
重復性差
可能原因:試劑批次不同或保存條件不當。
解決方法:固定試劑來源,分裝保存。
預檢測試劑背景
在使用前對試劑進行空白檢測,確保在200–300 nm無明顯吸收峰。
針對性匹配
不同檢測對象(DNA、RNA、蛋白)選擇專用緩沖液,避免交叉干擾。
高純度標準
優先使用分子生物學級或分析純級試劑。
定期更換
避免試劑長時間存放導致緩沖能力下降或污染。
統一標準
實驗室建立試劑選擇和保存SOP,保證不同人員操作一致。
研究人員使用含有高濃度NaCl的緩沖液,結果A260/A230比值偏低,影響純度判斷。改用低鹽Tris緩沖液后,結果恢復正常。
在用RIPA裂解液檢測蛋白濃度時,由于裂解液含有SDS和去污劑,在230 nm處產生高吸收,導致純度判斷失真。解決方案是更換為PBS稀釋后檢測。
某實驗因使用未處理的普通水稀釋RNA,導致RNA快速降解。改用DEPC處理水后,樣品保持穩定,結果準確。
NanoDrop Eight作為高效的微量分光光度計,其試劑選擇對實驗準確性和重復性有著決定性作用。不同實驗類型對試劑的純度、成分和背景吸收要求各異。科學合理地選擇和管理試劑,不僅能減少背景干擾,還能提高樣品定量的可靠性。
核酸檢測推薦使用超純水或低鹽Tris緩沖液;
RNA檢測推薦使用DEPC水;
蛋白檢測推薦使用PBS或HEPES緩沖液;
含鹽或有機溶劑的裂解液需謹慎使用。
通過建立標準化試劑選擇流程,配合NanoDrop Eight的高靈敏度檢測功能,實驗人員能夠獲得更精確、更可靠的結果,為科研和應用檢測提供堅實的數據支持。
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