Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)是賽默飛(Thermo Fisher Scientific)推出的經典實時PCR平臺之一,廣泛應用于生命科學研究、分子診斷、病原體檢測及基因定量分析等領域。該儀器具備高靈敏度檢測能力、穩定的熱循環系統和成熟的軟件操作平臺,能夠實現對核酸樣本的高效擴增與實時熒光監測。
熟練掌握ABI 7500的操作流程,不僅有助于實驗成功,也能確保數據質量和實驗重復性。以下內容將從設備準備、實驗設置、反應體系搭建、運行過程、數據分析、常見問題處理與儀器維護七大模塊系統介紹該儀器的使用方法。
確保儀器放置在干燥、無震動的環境中;
環境溫度建議維持在18℃~25℃,濕度控制在60%以下;
避免直射光和強磁干擾;
儀器后方預留通風空間不少于10厘米。
打開主機電源,系統自檢開始;
啟動連接的計算機,打開ABI 7500專用軟件;
軟件啟動后,自動連接儀器,顯示“Ready”狀態。
設計實驗前需明確以下要素:
檢測目的(基因表達、絕對定量、病原檢測等);
熒光方法(SYBR Green法或TaqMan探針法);
靶標基因與參考基因序列;
引物及探針設計需考慮特異性、Tm值、二聚體風險;
實驗設置包括樣本數、技術重復、標準曲線組數等。
組分 | 體積(μL) |
---|---|
2× Master Mix | 10 |
正向引物(10 μM) | 0.4 |
反向引物(10 μM) | 0.4 |
探針(10 μM) | 0.2(TaqMan) |
模板DNA | 2 |
ROX染料(如需) | 0.4 |
無RNA酶水 | 補足至20 μL |
注:ROX染料濃度根據使用的反應體系調整為Low ROX或High ROX,具體根據試劑說明書配置。
使用專用光學96孔板或八聯排管;
用移液器準確加樣,避免氣泡;
用光學膜封板,確保密封良好;
離心片刻,使液體集中在孔底。
ABI 7500軟件提供友好的人機交互界面,支持實驗設計、運行監控與數據分析功能。
打開“7500 SDS Software”;
點擊“File” → “New Experiment”;
選擇實驗類型:Standard Curve、Relative Quantitation、Genotyping 等;
命名文件并保存。
默認熱循環程序如下:
階段 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
---|---|---|---|
初始變性 | 95℃ | 10分鐘 | 1 |
變性 | 95℃ | 15秒 | 40 |
退火/延伸 | 60℃ | 1分鐘 | 40 |
如為Fast模式,可將退火/延伸縮短至30秒;
反應程序可自定義保存并復用。
切換至“Plate Setup”頁面;
錄入樣本名稱、靶基因名稱;
選擇每孔的檢測通道(FAM、VIC等);
設置是否包含標準樣、陰性對照、參考基因等。
確認樣本板放入儀器;
點擊“Start Run”,儀器自動執行程序;
可實時查看熒光信號曲線,監測擴增情況。
擴增曲線應呈“S”型;
曲線平滑、Ct值間隔一致,代表擴增效率正常;
若觀察到多個平臺或抖動,需排查試劑質量或移液問題。
軟件自動識別基線與閾值,生成Ct值;
若使用標準曲線法,可查看標準品線性關系與斜率;
標準曲線效率理想值為90%~110%(斜率 -3.1至 -3.6)。
選擇參考基因與校準樣本;
系統自動計算ΔCt、ΔΔCt與表達倍數變化(2^–ΔΔCt);
可視化柱狀圖輔助表達差異觀察。
結果可導出為Excel、CSV、PDF等格式;
可生成多圖合一實驗報告,便于保存與發表。
引物長度18-25 bp,Tm值在58-60℃;
避免重復序列、GC尾端或強互補序列;
探針應設計在引物中間區域,防止與引物重疊。
使用校準移液器;
每次更換槍頭;
盡量避免產生氣泡;
同一批次樣品按固定順序加樣。
使用原裝光學膠膜;
板面封膜后建議在3000 rpm下離心30秒;
防止揮發、氣泡或樣品不均影響擴增曲線。
問題現象 | 可能原因 | 解決方案 |
---|---|---|
無擴增曲線 | 模板濃度過低、酶失活 | 檢查模板質量,更新試劑 |
多條非特異曲線 | 引物設計不良 | 優化引物或提高退火溫度 |
Ct值漂移大 | 加樣誤差大 | 增加技術重復,精準操作 |
曲線突跳或平臺異常 | 光學干擾或氣泡 | 確保耗材干凈、樣品無氣泡 |
每次實驗結束后,清理熱循環模塊,用無塵布擦拭殘留物;
每周檢查熱蓋壓力、散熱風扇運行是否正常;
每月進行軟件備份、系統校準確認;
定期聯系廠家進行年度光學系統校準與維護;
避免重復使用老化的光學板或損壞耗材,確保熒光信號穩定性。
Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR儀作為一款經典的qPCR平臺,憑借其成熟的系統構架、穩定的反應條件和直觀的軟件設計,為生命科學與臨床檢測提供了高質量的核酸定量解決方案。掌握其標準化操作流程與優化策略,不僅可以提高實驗效率,也能確保實驗數據的準確性與可重復性。
對于科研人員而言,該設備是日常基因表達分析、病原檢測、SNP分析等工作的強大工具。而對于臨床實驗室,它則是建立標準核酸檢測流程的重要平臺。通過科學管理與合理維護,ABI 7500將持續為實驗室工作提供穩定支持。
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